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亞硝酸還原酶是一類(lèi)能夠催化亞硝酸鹽還原的酶類(lèi),亞硝酸還原酶大多存在細(xì)胞的內(nèi)部,能夠有效的降解掉細(xì)胞內(nèi)多余的亞硝酸鹽。催化的過(guò)程中,需要電子供體和傳遞體的參與,可以在無(wú)氧的條件下進(jìn)行。亞硝酸鹽在植物或微生物的體內(nèi),被酶降解為NO或NH3,從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累,降低亞硝酸鹽對(duì)生物體的傷害。它是氮循環(huán)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶,檢測(cè)亞硝酸鹽含量的方法有分光光度法、熒光分析法和高效液相色譜(HPLC)法等。
比色法測(cè)定原理:亞硝酸還原酶可將NO2-還原為NO,使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2-減少,即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)亞硝酸還原酶的活性。
配制試劑:Tris-HCl緩沖液,磷酸鉀緩沖液,甲基紫精,連二亞硫酸鈉。
樣品檢測(cè):取植物樣品,在緩沖液中,冰浴研磨,吸取1mL加入離心管,離心2分鐘,提取上清液 。
檢測(cè)過(guò)程:0.1mL提取液+1mL磷酸鉀緩沖液+0.05mLKNO2+0.05mL甲基紫精(對(duì)照品不加,以磷酸鉀緩沖液代替)+0.05mLH2O,最后加0.05mL連二亞硫酸鈉,反應(yīng)開(kāi)始了。渦流混勻,振蕩至甲基紫精的藍(lán)紫色都褪去。在25℃孵育30min,迅速取0.4mL反應(yīng)液,加H2O3.6mL,加1mL磺胺,加1mL萘胺,反應(yīng)30min后,在540nm的波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算出樣品中的亞硝酸鹽還原酶活力。