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植物的油菜素內脂是一種甾醇類的天然化合物,在植物的花粉、種子、莖和葉等部位都有發(fā)現(xiàn)。它對植物的生長發(fā)育起著重要的調節(jié)作用,比如促進植物生長,增加農作物的產(chǎn)量,提供農作物的抗病、抗旱、抗鹽、抗?jié)瘛⒖篃?、抗寒、減少除草劑對農作物的傷害等。在被子植物如扁豆、水稻、玉米、蕎麥、牽?;ā⑾蛉湛?、赤楊、柑橘等都存在油菜素內酯,在花粉和未成熟的種子中含量豐富,在莖中居中,在葉和果實中含量比較低。
檢測植物中油菜素內酯含量的方法有高效液相色譜(HPLC)法、液質聯(lián)用(LC-MS)法、酶聯(lián)免疫(ELISA)法。
1.高效液相色譜(HPLC)法
色譜條件的準備是做好實驗的關鍵,每個參數(shù)的調整都關系到最終的結果。色譜柱的選擇,流動相的配置,柱溫和檢測波長的設置,通過紫外檢測器獲取信號,并通過軟件得到色譜峰和數(shù)據(jù)。對樣品的處理要注意的,能從樣品中提取多少,每個步驟都不能忽略。不要把精力都放在檢測的過程上,因為檢測的時候已經(jīng)是在既定的條件了,能夠改變的就是在樣品處理的時候,盡可能的獲得準確的油菜素內酯。要測定樣品的化合物含量,就會用到標準曲線。標準曲線是標準品的濃度和對應色譜峰或峰面積的對應關系,或是回歸方程。它反應了濃度和色譜值的關系,在同樣的條件下,通過測定樣品的色譜值,可以還原出來濃度,也就是樣品中所含有的油菜素內酯含量。
2.液質聯(lián)用(LC-MS)法
上面是HPLC的檢測方法,具有靈敏度高,分離效果好、重現(xiàn)性強等特點。但為了獲得更為準確的數(shù)據(jù),就科研方面來說,是能夠用到質譜檢測器的。質譜檢測器,是一種基于化合物分子量的定量檢測方法。它是在液相分離的基礎上,進入質譜分析。這種方法靈敏度更高,選擇性很強,結果更準確。
3.酶聯(lián)免疫(ELISA)法
ELISA測植物體內的油菜素內酯,是通過雙抗體夾心法測定的。經(jīng)過純化的植物油菜素內酯抗體包被微孔板,制作出固相抗體。向包被了單抗的微孔中依次加入植物油菜素內酯,再和HRP標記的植物油菜素內酯抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物。經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色,TMB在HRP酶的作用下轉化為藍色,并在酸的作用下最終轉化為黃色。顏色的變化和反應的程度是呈線性關系的,用酶標儀在450nm波長下測定吸光度值,結合標準曲線,即可計算出樣品中植物油菜素內酯的含量。通常以試劑盒的形式出現(xiàn)。